Una proteina, la CFTR, come nuovo bersaglio terapeutico nella celiachia

Abbiamo intervistato Luigi Maiuri, Professore Ordinario in Pediatria dell’Università del Piemonte Orientale di Novara e Direttore Scientifico dell’ Istituto Europeo per la Fibrosa Cistica dell’ Ospedale San Raffaele di Milano e Marco Silano, Coordinatore del nostro Comitato Scientifico e Direttore dell’Unità Operativa Alimentazione, Nutrizione e Salute dell’Istituto Superiore di Sanità.

Insieme hanno pubblicato sulla rivista scientifica EMBO Journal lo studio “A pathogenic role for cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in celiac disease” che esplora nuove possibili frontiere per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della celiachia e soprattutto per l’identificazione di nuovi farmaci (o sostanze naturali) capaci di proteggere la mucosa intestinale dall’azione tossica della gliadina

Professor Maiuri, qual è la novità del lavoro che Lei ha coordinato e che è stato pubblicato dalla prestigiosa rivista scientifica EMBO Journal ? 

Il lavoro pubblicato recentemente sulla rivista EMBO Journal (V. Villella et al,  A pathogenic role for cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in celiac disease: Articolo consultabile all’indirizzo: emboj.embopress.org/cgi/doi/10.15252/embj.2018100101), è uno studio in collaborazione fra l’Università del Piemonte Orientale di Novara e  l’Istituto Europeo per la Ricerca sulla Fibrosi Cistica dell’Ospedale San Raffaele di Milano, dove svolgo la mia attività clinica e di ricerca, e  l’ Università Paris Descartes (Prof. Guido Kroemer), il Centro Regionale per la Fibrosi Cistica dell’Università Federico II di Napoli (Prof. Valeria Raia), l’ Istituto Superiore di Sanità (Dott. Marco Silano).  

La novità e l’importanza dello studio consistono innanzitutto nell’aver identificato il primo anello  della catena di eventi innescata dalla ingestione di glutine, il primo evento da cui derivano a cascata tutti gli effetti dannosi della gliadina sulla mucosa intestinale del celiaco. In altre parole, la rilevanza e l’innovazione dello studio consistono nell’aver identificato il “recettore mancante”, ancora ignoto, cioè la proteina che mette in comunicazione i peptidi della gliadina con la mucosa intestinale del celiaco.

Un recettore “particolare” in quanto si tratta di una proteina, la CFTR, che può essere vista come lo “scudo protettivo” della nostra mucosa intestinale che la gliadina è costretta ad abbattere per poter danneggiare l’intestino del celiaco.

La CFTR è una proteina che si trova sulla membrana delle cellule epiteliali, anche di quelle intestinali. Oltre alle note funzioni di canale per il trasporto di cloro e bicarbonati, CFTR è anche una proteina “di controllo”, cosidetta “proteina hub”, che regola cioè numerosi aspetti della fisiologia della cellula, come lo stress ossidativo, l’attivazione della Transglutaminasi 2,  l’autofagia e il traffico di proteine intracellulari.

E’ rilevante notare che la perdita di funzione della CFTR, come nel caso della Fibrosi Cistica,  una malattia ereditaria dovuta a mutazioni del gene  CFTR, determina uno squilibrio funzionale della cellula epiteliale che ricorda le modificazioni indotte dai peptidi della gliadina negli enterociti dei soggetti con celiachia. In questa nuova prospettiva è interessante notare che la prevalenza della celiachia è 3 volte maggiore nei pazienti con Fibrosi Cistica rispetto alla popolazione generale.

Pertanto, la nostra idea è stata quella di ipotizzare che i peptidi della gliadina dovessero compromettere la funzione della CFTR per poter danneggiare la mucosa intestinale del celiaco.

E’ noto che alcuni peptidi della gliadina, quali il peptide P31-43 (o P31-49) attivano la risposta immune innata e innescano uno stress cellulare con attivazione della Transglutaminasi 2 (TG2). Questo genera le condizioni favorevoli per l’attivazione dei linfociti T da parte dei peptidi immunodominanti (deamidati dalla TG2) in soggetti con HLA compatibile. 

Il nostro studio ha dimostrato che il peptide P31-43 lega, entro pochi minuti dal contatto con la mucosa intestinale, ad una parte specifica della proteina CFTR, il dominio NDB1, compromettendone in tal modo la funzione. La ridotta funzione della CFTR indotta dal legame con il P31-43 induce attivazione della Transglutaminasi 2 che lega il peptide P31-43 e si aggancia a sua volta alla CFTR formando un complesso molecolare stabile fra P31-43, Transglutaminasi e CFTR. Questo meccanismo stabilizza il legame fra P31-43 e CFTR e riduce ulteriormente la funzione della CFTR stessa.

La CFTR possiamo immaginarla come un canale che si apre e si chiude ciclicamente per consentire il traporto di ioni. Lo studio dimostra che se si riesce a mantenere aperto e funzionante questo canale prima che la gliadina arrivi in contatto con la CFTR, i peptidi non riescono piu’ a legarsi e la gliadina diventa “innocua”.

Pertanto questo studio identifica un nuovo e finora inatteso bersaglio molecolare per il disegno di nuovi farmaci che possano prevenire il legame fra il P31-43 e la CFTR e in ultima analisi la tossicità della gliadina per i celiaci.

Esistono farmaci già in uso per altre patologie, come la Fibrosi Cistica, in grado di mantenere il canale CFTR in una conformazione “aperta”. Fra questi il Kalideco (Ivacaftor o VX-770), un potenziatore della CFTR che nel nostro studio si è rivelato capace di impedire alla gliadina di agganciarsi alla CFTR e di antagonizzare gli effetti della gliadina sia in vivo in noti modelli murini di suscettibilità al glutine, che su cellule di pazienti con celiachia. Quando le cellule intestinali sono pre-incubate con VX-770 prima di essere esposti al P31-43, il peptide non lega piu’ la CFTR, non ne compromette la funzione e non innesca una reazione immunitaria. Pertanto, il VX-770 protegge l’intestino dagli effetti dannosi della gliadina (Figura 1).

Lo studio apre a nostro avviso nuove frontiere sia per la comprensione dei meccanismi molecolari alla base della celiachia, sia soprattutto per la identificazione di nuovi farmaci (o sostanze naturali) capaci di proteggere la mucosa intestinale dall’azione tossica della gliadina e consentire ai celiaci di convivere pacificamente con il glutine.


2) In che modo questa scoperta modifica quanto si sapeva finora sull'infiammazione intestinale nella celiachia ?
 

Maiuri: Come detto precedentemente, la scoperta del “recettore” per la gliadina, a cui il P31-43 è in grado di legarsi, rappresenta il primo anello della cascata di eventi nella celiachia. Ne consegue che gli eventi indotti dalla gliadina a valle del legame con la CFTR, quali il danno del citoscheletro con aumento della permeabilità intestinale, l’attivazione della TG2, l’attivazione di NF-kB con produzione di citochine infiammatorie, fra cui la IL-15, l’alterazione del meccanismo di autofagia e del traffico endosomiale, sono tutti fenomeni che possono essere controllati prevenendo “a monte” il legame della gliadina (e specificamente del P31-43) alla CFTR e come conseguenza, la perdita di funzione della CFTR che da il via alla cascata infiammatoria della celiachia.

Queste evidenze cambiano il nostro modo di interpretare l’infiammazione intestinale nella celiachia. Lo studio dimostra che la cascata infiammatoria indotta dal glutine è la conseguenza diretta della perdita di funzione di una proteina che orchestra l’omeostasi della cellula e detta i tempi e le regole della risposta allo stress sia endogeno che da agenti esterni presenti nel lume intestinale e la cui disfunzione determina una “disregolazione” dei maggiori sistemi cellulari di adattamento allo stress, quali l’autofagia.  Mantenere il canale CFTR in posizione “aperta” impedendo al P31-43 di legarsi ad essa e di comprometterne la funzione, diventa un rimedio per combattere l’infiammazione indotta dal glutine.

I nostri studi in vivo su modelli animali noti di suscettibilità al glutine, hanno infatti dimostrato che il trattamento con Ivacaftor (quindi un intervento a monte della infiammazione che previene la caduta di funzione della CFTR) previene l’incremento dei livelli di citochine infiammatorie, quali IL17, IL1b, IL-15, così’ come i livelli di IFNg, mentre induce un incremento dei livelli di IL10.

Questi effetti sono stati riprodotti anche su cellule mononucleate del sangue periferico (PBMC) di soggetti celiaci coltivati in un modello di cultura bidimensionale con cellule epiteliali. In questo modello, lo studio ha confermato che la molecola Ivacaftor previene la produzione di IFNg da parte delle PBMNC dei celiaci indotta dalla gliadina e induce aumento dei livelli di IL-10.

Pertanto, potenziando la funzione della CFTR si ripristina nel celiaco un comportamento di tipo tollerogenico, anziche pro-infiammatorio nei confronti della gliadina (Figura 1).

 

3) Quali saranno i prossimi step della vostra ricerca, alla luce dei risultati ottenuti ? 

Maiuri: Ovviamente il prossimo step sarà promuovere uno studio clinico per definire le modalità, le dosi e i tempi di somministrazione di Ivacaftor (o di altri potenziatori di CFTR) in relazione all’ingestione del glutine.

Inoltre, questo studio apre scenari del tutto nuovi. Infatti, l’identificazione del bersaglio della gliadina nelle cellule epiteliali intestinali apre la strada ad una nuova strategia di drug discovery volta alla identificazione di molecole in grado di prevenire il legame fra il peptide della gliadina e la proteina CFTR. Come detto precedentemente, queste strategie mirano ad interferire sul primo evento conseguente alla ingestione di glutine nel soggetto celiaco, evento da cui derivano le altre manifestazioni (quali alterazioni del citoscheletro, aumento di permeabilità intestinale, alterazioni del traffico intracellulare, attivazione T cellulare, infiammazione).

A tal proposito si possono ipotizzare diverse strategie. Innanzitutto Identificare e validare altre molecole con effetto di potenziamento della funzione della CFTR. Fra queste, non solo farmaci ma anche sostanze naturali (nutraceutici) che offrono l’indubbio vantaggio di un profilo di sicurezza ben noto e un costo di sviluppo ridotto.

Altra strada è il disegno di peptidi antagonisti che possano competere con il legame fra il dominio NBD1 della CFTR e il P31-43.

Inoltre il nostro studio propone anche un modello versatile per poter testare l’efficacia di sostanze “protettive” nei confronti della tossicità della gliadina nei celiaci. Le PBMC in un sistema di coltura bidimensionale con le cellule epiteliali, consentono di riprodurre un ambiente che mima la mucosa intestinale e in cui possono essere testati farmaci o sostanze naturali derivate dal percorso di drug discovery.

4) questa scoperta avvicina il giorno i cui i celiaci potranno consumare in sicurezza alimenti contenenti glutine ? 

Silano: La possibilità di intervenire sull’evento iniziale della cascata patogenetica della celiachia rappresenta indubbiamente un grande passo in avanti nel disegno di una terapia che possa consentire, in tempi che si sperano brevi, ai soggetti celiaci di consumare glutine. Inoltre, altre terapie attualmente in sperimentazione clinica, quali la molecola anti-zonulina, la lazarotide e gli inibitori di IL-15, che agiscono su eventi a valle del bersaglio da noi identificato ma che finora hanno dato risultati non del tutto soddisfacenti , possono beneficiare di un simultaneo intervento con potenziatori della CFTR che riduca drasticamente gli effetti dannosi del glutine e quindi agevoli il percorso delle terapie in fase di sperimentazione.


Figura 1: Schema patogenetico della celiachia. 

fig_1.png


Il peptide P31-43 si lega a specifici residui del dominio NBD1 della CFTR se questo è nella sua forma inattiva, compete con il bonding dell'ATP, bloccando in tal modo la funzione della CFTR.

L'inibizione della CFTR altera la proteostasi cellulare mediante 2 effetti: i) attivazione della TG2 e inibizione del complesso Beclin 1.

Questi eventi richiamano la TG2 a formare un complesso trimolecolare con il peptide P31-43 e la CFTR che stabilizza il legame del peptide al dominio NBD1 e rafforza l'inibizione della CFTR.

L'inibizione della CFTR indotta dal legame con il P31-43 compromette il traffico endosomiale, danneggia il citoscheletro con conseguente aumento della permeabilità intestinale, attiva l'inflammasoma, attiva NF-kB inducendo in tal modo incremento dei livelli di citochine infiammatorie.

Lo stress dell'enterocita che si determina stimola una infiammazione locale e una risposta immune ai peptidi immunodominani (P33-mer) della gliaina in un contesto HLA-DQ2/DQ8.

Questa cascata patogenetica puo' essere interrotta a due livelli: i) a monte, cioè prevenendo il legame del P31-43 alla CFTR per mezzo di potenziatori della CFTR (come l'Ivacaftor) o ii) ripristinando la proteostasi cellulare mediante inibitori di TG2 o attivatori del complesso Beclin 1.

 

RIFERIMENTI DELLO STUDIO

A pathogenic role for cystic fibrosis transmembrane conductance regulator in celiac disease:

VR Villella, A Venerando, G Cozza, S Esposito, E Ferrari, R Monzani, MC Spinella, V Oikonomou, G Renga, A Tosco, F Rossin, S Guido, M Silano, E Garaci, Y-K Chao, C Grimm, A Luciani, L Romani, M Piacentini, V Raia, G Kroemer & L Maiuri.

The EMBO Journal, 2018; e100101 DOI: 10.15252/embj.2018100101  

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