BANDO FC 2014 Peer Review


PROGETTI CONCLUSI


Grant FC 007/2014

Studio del microbioma intestinale nella patogenesi della celiachia nell’adulto

Ricercatore Titolare: Lucia Sacchetti
Affiliazione: CEINGE-Biotecnologie Avanzate, Napoli

 

Scheda dello studio

- Numero del Finanziamento (Grant): FC 007/2014

- Titolo:  Studio del microbioma intestinale nella patogenesi della celiachia nell’adulto

- Area Scientifica: Genetica della Celiachia

- Durata: Progetto Biennale

- Ricercatore Titolare: Dott.ssa Lucia Sacchetti, CEINGE-Biotecnologie Avanzate, Napoli

- Collaborazioni: Giovanna Del Vecchio Blanco, Unità di Gastroenterologia, Università di Roma Tor Vergata; Paola Salvatore, Dipartimento di Medicina Molecolare e Biotecnologie mediche, Università di Napoli “Federico II”

- Pubblicazioni originate dal Grant:

- V. D’Argenio et al. Metagenomics Reveals Dysbiosis and a potentially pathogenic N. flavescens strain in duodenum of adults celiac patients. The American Journal of Gastroenterology (2016); doi:10.1038/ajg.2016.95

- V. D’Argenio et al. No change in the mucosal gut mycobioma is associated with celiac disease-specific microbiome alteration in adult patients. The American Journal of Gastroenterology (2016); doi:10.1038/ajg.2016.227

 

 

Lo studio:

Cosa si è voluto studiare e perché?

Il corpo umano rappresenta un ecosistema nel quale coesistono trilioni (1018) di batteri ed altri microrganismi (microbiota) che popolano il nostro organismo. In particolare, il sistema digestivo (tratto gastrointestinale) è formato da diverse nicchie funzionalmente distinte: la cavità orale, lo stomaco, il piccolo intestino ed il colon, ciascuna popolata da microrganismi in parte diversi, che contribuiscono allo svolgimento di numerose importanti funzioni, quali: la sintesi di vitamine, la decomposizione di sostanze chimiche e di nutrienti, il metabolismo dei grassi, lo sviluppo del sistema immune, la lotta a germi patogeni, etc. Il microbiota umano è variabile nelle diverse nicchie e nei diversi individui, essendo modificato da: dieta, antibiotici, stile di vita, etc. Stabilire quindi l’esatta composizione del microbiota in condizioni di salute o in corso di malattie, rappresenta una sfida. Nella celiachia, in aggiunta alla predisposizione genetica (in gran parte legata alla presenza delle molecole di suscettibilità HLA DQ2/DQ8) ed all’ingestione del fattore scatenante “glutine”, ad alcune infezioni virali, anche il microbiota intestinale è stato suggerito svolgere un ruolo importante. Oggi, grazie a tecniche molto sensibili di sequenziamento del DNA batterico (tecniche metagenomiche), è possibile studiare tutto il microbioma intestinale, al contrario delle classiche tecniche microbiologiche (basate sulla coltivazione delle specie batteriche su terreni selettivi), che consentono di studiare solo le specie coltivabili.

Ciò premesso, gli obiettivi del nostro studio sono stati i seguenti: (1)- studiare il microbioma intestinale di soggetti adulti appartenenti a tre gruppi, soggetti celiaci attivi (CD), celiaci a dieta senza glutine (GFD) e soggetti controllo, con tecniche metagenomiche. Ciò al fine di valutare se esisteva un profilo microbico alterato associato alla malattia celiaca. (2) Studiare negli stessi tre gruppi di soggetti (CD, GFD e controlli) la comunità batterica intestinale anche con tecniche classiche di coltura. Ciò al fine di paragonare i dati microbiologici colturali (microbiota) con quelli genetici (microbioma) (di cui al punto1) ed eventualmente isolare ed identificare le specie batteriche differenti tra CD, GFD e controlli. (3) Valutare, nel caso di isolamento di specie batteriche associate alla celiachia, se esse avevano potere infiammatorio e capacità di influenzare talune funzioni dell’epitelio intestinale.

 

La Metodologia

Lo studio è stato approvato dal Comitato Etico dell’Università Federico II di Napoli e, previa raccolta del consenso informato, sono stati arruolati 97 soggetti (34 CD attivi, 28 GFD e 35 controlli). Il microbioma intestinale è stato valutato, nei campioni duodenali di 41 soggetti e nei tamponi orofaringei di ulteriori 56 soggetti, sia con tecniche metagenomiche (studio del 16S rRNA) che con tecniche colturali. Le sequenze di DNA batterico sono state analizzate tramite programmi bioinformatici (QIIME v.1.9.1). Il potere infiammatorio della specie batterica CD-associata (Neisseria flavescens-Nf) è stato testato su cellule dendritiche di topo ed umane, nonché su espianti intestinali (in vitro). Il traffico intracellulare della Nf isolata dai CD e dai controlli è stato valutato in cellule epiteliali CaCo2 ottenute dalla Banca Cellule del CEINGE, Napoli.

 

Quali Risultati?

Nei celiaci in fase attiva il phylum più abbondante è risultato il Proteobacteria, seguito da quello dei Bacteroidetes, mentre Actinobacteria e Firmicutes erano quelli meno presenti. Sono stati poi identificati classe, ordine, famiglia e genere in ogni phylum. All’interno della classe dei Beta-proteobacteria, l’ordine Neisseriales, la famiglia Neisseriaceae e il genere Neisseria, sono risultati essere significativamente più presenti nei CD attivi che negli altri due gruppi. Altro risultato interessante è stato quello che nell’orofaringe dei soggetti CD attivi abbiamo trovato un simile profilo microbico, caratterizzato dall’aumento dei Proteobacteria e in particolare del genere Neisseria. L’esame colturale ha consentito di stabilire la vitalità microbica delle Neisserie e di identificare la N.flavescens (Nf) come specie più abbondante nei soggetti CD attivi rispetto agli altri due gruppi. Nella Figura 1 sono riassunti i risultati ottenuti.

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Figura 1 - 
Composizione del microbioma intestinale (duodenale) in controlli (a), celiaci attivi (b) e a dieta senza glutine (GFD) (d).In (c) il microbiota orale presenta un’alterazione microbica (aumento della Neisseria Flavescens) simile a quella osservata nell’intestino.

 

A questo punto abbiamo voluto approfondire quale potesse essere il significato dell’aumento della Nfnei celiaci attivi, valutandone alcune caratteristiche. Dapprima ne abbiamo esplorato la capacità infiammatoria. Ciò è stato effettuato con due diversi approcci: in primo luogo abbiamo usato cellule dendritiche (DCs)(sia di topo che umane), entrambe sono state trattate per 48 ore con la Nf (lisato) isolata dal duodeno di soggetti celiaci attivi, e poi nel surnatante sono stati misurati i livelli di IL-12p40 e TNF-α (indicatori di infiammazione), che sono risultati significativamente più alti rispetto a quelli misurati in DCs non trattate. In secondo luogo abbiamo esposto espianti di mucosa duodenale ex-vivo di soggetti controllo alla Nf valutando poi l’aumento di marcatori di infiammazione quali l’ HLA-DR e COX-2. Nella Figura 2 sono riassunti i risultati ottenuti. Successivamente abbiamo esplorato l’internalizzazione e la localizzazione intracellulare della Nf osservando che esse sfuggono al compartimento lisosomiale ed anche questo può rappresentare fonte di stress (V. D’Argenio et al.; AJG 2016).


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Figura 2 - 
Il microbiota intestinale e gli altri fattori patogenetici nella celiachiaLa Neisseria flavescens (Nf) isolata dai pazienti celiaci attivi induce un profilo pro-infiammatorio in cellule dendritiche (DCs) e nell’epitelio intestinale con il rilascio di marcatori di infiammazione (TNF-α, IL-12p40). 

 

Quali prospettive e quali benefici per i pazienti celiaci? 

Il nostro studio ha individuato alterazioni nel microbiota intestinale dei soggetti celiaci che sono caratterizzate in particolare dall’aumento di un batterio: la Neisseria flavescens. Abbiamo dimostrato che tale batterio è capace di indurre infiammazione nell’epitelio intestinale di soggetti sani, indipendentemente quindi da altri fattori predisponenti alla celiachia. Se quest’alterazione batterica precede (causa) o segue (conseguenza) le alterazioni a livello intestinale caratteristiche della patologia non è possibile ancora dirlo, ma certamente essa rappresenta un fattore associato che concorre allo stato infiammatorio dell’epitelio intestinale. Di grande interesse è anche aver stabilito che a livello del tratto gastrointestinale c’è una linea di continuità tra il microbioma del cavo orale (orofaringe) e quello del duodeno, infatti, abbiamo trovato un profilo microbico molto simile in questi due siti. Quest’ultimo risultato può rappresentare un grande vantaggio per il paziente, in quanto raccogliere un tampone faringeo da utilizzare per lo studio del microbioma è certamente una procedura meno invasiva di quella per la raccolta della biopsia duodenale.

 

Eventuali sviluppi futuri del progetto

Molti dati relativi al microbioma nella celiachia sinora presenti in letteratura sono caratterizzati da scarsa riproducibilità, dovuta a diversi fattori: l’impiego di metodologie diverse, diversi campioni biologici studiati (feci, saliva, duodeno) e differenti gruppi di pazienti arruolati (per età, sesso,criteri di inclusione, etc.), per cui certamente confermare i dati da noi ottenuti su altre coorti di pazienti rappresenta una progettualità importante da sviluppare in futuro. Ma lo sviluppo a nostro avviso più importante sarà quello relativo alle informazioni ottenibili dal microbioma orale che, dai nostri risultati, sembra comparabile a quello ottenuto nel duodeno. In particolare, uno dei nostri obiettivi futuri sarà quello di valutare il microbioma orofaringeo nei soggetti CD che iniziano la dieta senza glutine per monitorarne le variazioni sino al ripristino della normalità. Ciò potrebbe rappresentare un nuovo test diagnostico da utilizzare per il monitoraggio dell’efficacia della GFD.

 

Legenda

Microbiota Con il termine microbiota umano ci riferiamo alla composizione microbica che prospera sul e nel nostro organismo, in pratica la classificazione tassonomica delle varie specie, per lo più batteriche, ma anche in misura minore archeobatteri, virus e miceti che ci abitano. Si tratta in pratica di trilioni di cellule microbiche. L’aggettivo umano serve a chiarire che si tratta di un microbiota (in particolare quello intestinale) che è abbastanza diverso da quelli riscontrati in diversi habitat naturali e che, probabilmente, è evoluto insieme al genoma umano.

Microbioma Con il termine microbioma ci riferiamo alla caratterizzazione dei microbi a livello genico, cioè alla identificazione del genoma microbico.

Tecniche Metagenomiche Con questo termine ci si riferisce alle tecniche molecolari di indagine del microbiota, all’inizio ci si riferiva al sequenziamento completo di tutto il genoma microbico, poi questo termine è stato esteso anche alla caratterizzazione genetica microbica tramite marcatori genetici quali il 16S rRNA.

Tecnica di sequenziamento della regione 16S rRNA E’ una tecnica metagenomica. Si tratta della caratterizzazione genetica microbica tramite impiego di marcatori genetici quali il gene 16S rRNA (RNA ribosomiale). Questo gene (che ha un basso tasso di mutazione) contiene zone altamente conservate (universali e che quindi non ci consentirebbero di identificare le varie specie batteriche in quanto uguali in tutti i batteri), regioni semiconservate (hanno sequenza uguale tra batteri dello stesso Taxon-Regno) e regioni variabili (che sono uguali solo in batteri della stessa specie. Queste ultime regioni, di qualche centinaia di basi, sono nove V1-V9, e ci consentono di discriminare tra diversi taxa batterici. Con questa tecnica si riesce infatti a definire, nell’ambito del regno dei batteri, i diversi phyla, le classi , gli ordini, le famiglie, i generi e le specie che compongono il microbioma di un distretto corporeo.

Cellule dendritiche (DCs) Cellule che appartengono al sistema immunitario e hanno la funzione di presentare l’antigene ai linfociti B e T. Le cellule dendritiche nascono dalle cellule staminali emopoietiche nel midollo osseo e sono le più importanti dell’insieme delle APC (Antigen presenting cell), insieme ai macrofagi e ai linfociti B. Il loro nome deriva dalla particolare forma ramificata che assumono.

HLA-DR Molecola del sistema maggiore di istocompatibilità di classe II.

COX-2 Enzima indotto rapidamente in monociti o macrofagi da stimoli pro-infiammatori.

 

Pubblicazioni originate dal Grant:

  1. D’Argenio V. et al. Metagenomics Reveals Dysbiosis and a potentially pathogenic N. flavescens strain in duodenum of adults celiac patients. The American Journal of Gastroenterology (2016); doi:10.1038/ajg.2016.95.
  2. D’Argenio V. et al. No change in the mucosal gut mycobioma is associated with celiac disease-specific microbiome alteration in adult patients. The American Journal of Gastroenterology (2016); doi:10.1038/ajg.2016.227.



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Grant FC 014/2014 


Studio del microbioma intestinale nella patogenesi della celiachia nell’adulto



Ricercatore Titolare: Giovanna Del Pozzo
Affiliazione: Istituto di Genetica e Biofisica-CNR, Napoli

Scheda dello studio

- Numero del Finanziamento (Grant): FC 014/2014

- Titolo: Studio dell’espressione genica degli alleli HLA-DQ associati alla malattia celiaca nell’induzione di una risposta immunitaria anti-glutine da parte dei linfociti T CD4

- Area scientifica: Genetica e Immunologia della malattia celiaca

- Durata: Progetto Annuale

- Ricercatore titolare: Dott.ssa Giovanna Del Pozzo, Primo Ricercatore CNR, Istituto di Genetica e Biofisica del CNR di Napoli (IGB-CNR)

- Collaborazioni: Dott.ssa Carmen Gianfrani, Istituto di Biochimica delle Proteine del CNR (IBP-CNR)

- Pubblicazioni originate dal Grant:
J. of Autoimmunity 2016 Jun;70:63-72

 

Lo studio:

Cosa si è voluto studiare e perché?

La maggior parte dei pazienti celiaci presenta nel proprio corredo cromosomico i geni DQA1*05 e DQB1*02, definiti “predisponenti o di rischio”. I geni di rischio possono essere in duplice copia (omozigosi, ossia presenti su entrambi i cromosomi) o in singola copia (eterozigosi, ossia presenti su uno solo dei due cromosomi). È noto che la presenza di questi geni predisponenti in un individuo sano che ha parenti di primo grado affetti da celiachia costituisce un fattore di rischio, ossia di predisposizione allo sviluppo della malattia.

I geni DQA1*05 e DQB1*02 portano, attraverso un passaggio intermedio che comporta la formazione di molecole dette RNA messaggeri, alla produzione della molecola HLA-DQ2.5 che è espressa sulla superficie di alcune cellule dette “presentanti”. L’HLA-DQ2.5 ha un ruolo fondamentale nella celiachia perché è una molecola che lega alcune parti del glutine e stimola la reazione immunitaria ad opera dei linfociti T CD4. Questi linfociti, una volta attivati, cominciano a proliferare e infiltrano la mucosa dell’intestino tenue determinando il danno dell’organo (atrofia dei villi).

Secondo le attuali teorie (Figura 1), la configurazione genetica dei geni di rischio (omozigosi oppure eterozigosi) influenzerebbe l’efficacia con cui viene stimolato il sistema immunitario (quindi la risposta infiammatoria), e quindi l’individuo omozigote e quello eterozigote dovrebbero presentare un diverso rischio di sviluppare la malattia, dando luogo così a classi diverse di soggetti a rischio.

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FIGURA 1 – Secondo l’attuale teoria genica, il rischio di sviluppare la celiachia e la gravità della malattia dipendono soprattutto dalla configurazione genetica dell’individuo (omozigote o eterozigote) per i geni predisponenti:
questo non spiega alcune incongruenze trovate nella classificazione dei pazienti nelle diverse classi di rischio. Partendo da questo scenario, lo studio ha inteso verificare la teoria del rischio genetico in funzione della configurazione dei geni di rischio, mediante misurazioni non solo della proteina HLA-DQ2.5, ma anche valutando quantitativamente il processo di formazione degli RNA messaggeri che portano alla proteina, in quanto si tratta di un passaggio chiave nella regolazione del fenomeno immunitario.


Partendo da questo scenario, lo studio ha inteso verificare la teoria del rischio genetico in funzione della configurazione dei geni di rischio, mediante misurazioni non solo della proteina HLA-DQ2.5, ma anche valutando quantitativamente il processo di formazione degli RNA messaggeri che portano alla proteina, in quanto si tratta di un passaggio chiave nella regolazione del fenomeno immunitario.

La metodologia:

Nello studio, cellule T CD4 glutine-specifiche sono state stimolate con cellule prelevate da pazienti celiaci sia omozigoti che eterozigoti per i geni di rischio (cellule presentanti), misurando poi la risposta immunitaria delle cellule T CD4 in funzione sia della quantità di proteina HLA-DQ2.5 sia dell’RNA messaggero espressi dalle cellule presentanti.

Quali risultati?

I risultati hanno dimostrato che la configurazione genetica dei geni di rischio HLA DQA1*05 e DQB1*02 (omozigote o eterozigote) nelle cellule presentanti dei pazienti celiaci da sola non basta a spiegare l’attivazione infiammatoria delle cellule T CD4. La quantità di proteina HLA-DQ2.5 che lega il glutine e attiva la risposta immunitaria sembra invece dipendere soprattutto dai processi di formazione e regolazione dell’RNA messaggero negli omozigoti e negli eterozigoti: quando i geni predisponenti sono su un solo cromosoma (eterozigosi), essi tendono a produrre molto più RNA rispetto ai corrispettivi geni sull’altro cromosoma e quindi compensano l’effetto rispetto a quando sono presenti su entrambi i cromosomi (omozigosi). Si veda Figura 2.

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FIGURA 2 – Lo studio ha dimostrato che la quantità di proteina HLA-DQ2.5 che lega il glutine e attiva la risposta immunitaria non dipende solo dal fatto che un individuo sia omozigote o eterozigote per i geni HLA predisponenti, ma sembra dipendere soprattutto dai processi di formazione e regolazione dell’RNA messaggero negli omozigoti e negli eterozigoti: quando i geni predisponenti sono su un solo cromosoma (eterozigosi), essi tendono a produrre molto più RNA rispetto ai corrispettivi geni sull’altro cromosoma e quindi compensano l’effetto rispetto a quando sono presenti su entrambi i cromosomi (omozigosi). Questo potrebbe spiegare perché l’attuale teoria del dosaggio genetico (omozigote verso eterozigote) da sola non chiarisce alcune incongruenze trovate quando si vuole classificare il grado di rischio nei pazienti celiaci.


Si tratta di un risultato che potrebbe spiegare a livello molecolare perché l’attuale teoria del dosaggio genetico (omozigote verso eterozigote) da sola non chiarisce alcune incongruenze trovate quando si vuole classificare il grado di rischio nei pazienti celiaci. Lo studio aggiunge un ulteriore livello di valutazione della predisposizione alla celiachia in un soggetto a rischio: non solo la configurazione genetica dei geni di rischio ma anche i processi regolatori di formazione della proteina HLA-DQ2.5 (gli RNA messaggeri).

Quali prospettive e quali benefici per i pazienti celiaci?

In futuro, partendo da queste nuove acquisizioni molecolari sul processo di attivazione della risposta infiammatoria nel paziente celiaco, si potrà arrivare a progettare un dispositivo diagnostico che consenta di determinare non solo il genotipo ma anche la quantità di RNA dei geni predisponenti, e quindi prevedere il rischio di sviluppare la celiachia nei soggetti a rischio, e la gravità della malattia in ogni singolo paziente.

Ulteriori studi saranno necessari per capire qual è il meccanismo molecolare che genera una elevata produzione di molecole di RNA da parte dei geni HLA DQA1*05 e DQB1*02 nei soggetti eterozigoti. 

Eventuali sviluppi futuri del progetto

L’attività scientifica alla base del progetto è tuttora in corso e focalizzata allo studio dell’espressione dei geni HLA di rischio in pazienti con un assetto genico diverso. Inoltre uno degli obiettivi principali sarà quello di identificare i meccanismi molecolari a livello genomico che regolano i geni di rischio e determinano una elevata produzione di molecole HLA-DQ2.5.

Legenda:

HLA (Human Leukocytes Antigens) sono le molecole espresse sulla superficie delle cellule “presentanti l’antigene” (dette brevemente cellule presentanti), le quali legano i peptidi del glutine e li presentano ai linfociti T CD4
Omozigosi è la condizione in cui le due copie di un gene (alleli, nel nostro caso i geni HLA predisponenti) presenti su entrambi i cromosomi sono identiche e producono lo stesso prodotto (proteina) 
Eterozigosi è la condizione in cui le due copie di un gene (alleli) presenti su entrambi i cromosomi sono differenti e producono un prodotto proteico diverso; quindi nel nostro caso, solo uno dei cromosomi produce l’HLA predisponente
B-LCL (B-Lymphoblastoid Cell Lines): linfociti B estratti da sangue periferico di pazienti celiaci, si tratta di cellule presentanti. Portano le molecole HLA sulla loro superficie
Cellule dendritiche: Cellule immunitarie estratte da sangue periferico di pazienti celiaci, si tratta di cellule presentanti. Portano le molecole HLA sulla loro superficie
Linfociti T CD4 glutine-specifici: cellule che riconoscono i peptide del glutine quando questi si legano alle molecole HLA delle cellule presentanti, e in seguito al riconoscimento si attivano, proliferano e innescano una risposta infiammatoria mediata da molecole dette citochine, come la molecola IFNg
Espressione: rappresenta la quantità di molecole di RNA messaggero generate a partire da un gene e quindi la quantità di molecole di proteine prodotte a partire dall’RNA messaggero 
real-time qRT-PCR (Quantitative Reverse transcription polymerase chain reaction): Metodo per la quantificazione degli RNA nella cellula 
citofluorimetria: È una tecnica che attraverso l’utilizzo di un laser consente il conteggio, la separazione e il rilevamento delle cellule

 

Pubblicazioni originate dal Grant

  1. Pisapia L. et al. - HLA-DQ2.5 genes associated with celiac disease risk are preferentially expressed with respect to non-predisposing HLA genes: Implication for anti-gluten T cell response. J Autoimmun. 2016 Jun;70:63-72. doi: 10.1016/j.jaut.2016.03.016. Epub 2016 Apr 12

 


Lo studio: approfondimenti

Lo scenario e gli obiettivi prefissati
: Circa il 95% degli individui affetti da celiachia possiede i geni HLA-DQA1*05 e HLA-DQB1*02 che determinano la produzione della molecola HLA-DQ2.5. Queste molecole hanno un ruolo chiave nella risposta immunitaria, in quanto legano quelle porzioni del glutine che vengono definite antigeni, riconosciuti come estranei dal nostro organismo, e attivano le cellule del sistema immunitario come i linfociti T CD4. I geni HLA che conferiscono il rischio di celiachia possono essere presenti su entrambi i cromosomi numero 6 (si parla allora di individuo omozigote per i geni di rischio) oppure su uno solo dei due cromosomi numero 6 (individuo eterozigote per i geni di rischio), mentre l’altro cromosoma 6 porta una variante (allele) dello stesso gene che non è associato alla malattia celiaca. Ciò ha fatto supporre che la molecola HLA-DQ2.5 debba essere presente, sulla superficie della cellula in cui viene prodotta, in una quantità variabile a seconda che il soggetto sia omozigote o eterozigote, il che a sua volta influenza l’intensità della reazione infiammatoria intestinale. Infatti i dati di letteratura riportano una correlazione tra il numero dei geni di rischio e la classificazione clinica cioè il livello di rischio di ammalarsi di celiachia. In altre parole è stato descritto un effetto legato al “numero di geni di rischio”, per cui secondo l’attuale teoria i soggetti omozigoti per i geni DQA1*05 e DQB1*02 dovrebbero avere sempre un rischio più alto di ammalarsi rispetto agli individui eterozigoti, in quanto stimolerebbero una reazione infiammatoria più elevata nei confronti del glutine introdotto con la dieta (Figura 1). Tuttavia questo modello non riesce da solo a spiegare alcune incongruenze che si trovano nel raggruppamento dei pazienti nelle varie classi di rischio.

Partendo da questo scenario, lo studio si è posto i seguenti obiettivi:

  1. confrontare l’intensità della risposta infiammatoria dei linfociti T CD4 glutine-specifici indotta dalle cellule immunitarie (dette presentanti perché legano il glutine e lo presentano ai linfociti T) prelevate da pazienti celiaci omozigoti con quella indotta dalle cellule presentanti prelevate da pazienti celiaci eterozigoti per i geni HLA di rischio
  2. misurare in tutti i casi studiati l’effettiva espressione sulla superficie delle cellule presentanti delle molecole HLA-DQ2.5 e la quantità dei corrispondenti RNA messaggeri che costituiscono la fase intermedia di produzione delle molecole HLA-DQ2.5, la fase soggetta a processi di regolazione e quindi di fondamentale importanza nel determinare sia la quantità di molecole HLA-DQ2.5 sia l’intensità della risposta infiammatoria

Il metodo: Lo studio è stato effettuato adoperando cellule immunitarie presentanti (che legano il glutine attraverso le molecole HLA e lo presentano ai linfociti T) ricavate da pazienti celiaci sia omozigoti che eterozigoti, e da soggetti sani come campione di controllo, per un totale di 20 soggetti. In particolare sono stati usati i linfociti B (B-LCL) e le cellule dendritiche. Si tratta di cellule predisposte a monitorare la presenza nell’organismo di agenti estranei (quali il glutine) e, nel caso, ad attivare la risposta immunitaria. Le cellule presentanti sono state impiegate in test sia funzionali che molecolari. I test funzionali consistono nell’utilizzare le B-LCL e le cellule dendritiche come cellule che presentano i peptidi della gliadina (un componente del glutine) per attivare i linfociti T CD4 glutine-specifici precedentemente selezionati da biopsie di pazienti celiaci. L’attivazione dei linfociti T CD4 glutine-specifici è stata misurata mediante la quantificazione della citochina infiammatoria IFNγ. Per quanto riguarda i test molecolari è stata utilizzata sia la citofluorimetria a flusso, per quantificare le molecole HLA-DQ2.5 che erano presenti sulla superficie delle cellule presentanti, sia la real-time-PCR (qRT-PCR), per quantificare gli RNA messaggeri prodotti dai geni di rischio HLA-DQA1*05 e HLA-DQB1*02. Gli RNA messaggeri sono molecole intermediarie che sono prodotte a partire dai geni e servono a loro volta a generare le proteine, in questo caso le molecole HLA-DQ2.5, per cui la loro produzione e il loro funzionamento è soggetto a stretta regolazione da parte delle cellule: gli RNA messaggeri sono una delle fasi chiave nella produzione delle molecole HLA-DQ2.5 e quindi nel processo di induzione della risposta infiammatoria correlata alla celiachia.

I risultati: Le B-LCL e le cellule dendritiche dei pazienti eterozigoti ed omozigoti, cioè rispettivamente con una o due copie dei geni di rischio DQA1*05 e DQB1*02, sono quindi state utilizzate come “cellule presentanti” i peptidi antigenici del glutine al fine di stimolare la proliferazione di linfociti T CD4 selezionati dalle biopsie dei pazienti. Si è visto che i linfociti T CD4 hanno proliferato in maniera paragonabile, cioè hanno indotto una risposta infiammatoria simile nonostante che ci si aspettasse che la quantità di antigene del glutine presentata dalle molecole HLA fosse diversa a seconda che la cellula presentante fosse omozigote o eterozigote. Detto in altri termini, dai risultati quantitativi ci si aspettava che, in base alle attuali conoscenze, l’individuo omozigote avesse sulle sue cellule presentanti più molecole di HLA rispetto all’individuo eterozigote, e quindi portasse ad una presentazione del glutine (e ad un’attivazione delle cellule T CD4) più massiccia rispetto all’individuo eterozigote. Invece si è osservato che l’intensità della risposta infiammatoria è la stessa in entrambi i casi. Per spiegare perché il test funzionale era uguale, è stata misurata la quantità di molecola DQ2.5 sulla superficie delle cellule presentanti: tale quantità non cambia in maniera significativa a seconda del genotipo omozigote o eterozigote delle cellule. A sua volta, per spiegare perché il numero di molecole HLA DQ2.5 fosse uguale, è stata misurata la quantità degli RNA messaggeri prodotti dai geni DQA1*05 e DQB1*02. Si è visto che la risposta al quesito è proprio nella produzione di RNA negli omozigoti e negli eterozigoti (Figura 2): quando i geni predisponenti sono su un solo cromosoma (eterozigosi), essi tendono a produrre molto più RNA rispetto ai corrispettivi geni sull’altro cromosoma  e quindi compensano l’effetto rispetto a quando sono presenti su entrambi i cromosomi (omozigosi).

In conclusione i risultati rappresentano un completamento della teoria comunemente accettata del “dosaggio dei geni HLA”, cioè per l’instaurarsi dello stato patologico non è importante solo la presenza di una o due copie di geni di rischio DQA1*05 e DQB1*02, ma anche la quantità di RNA e quindi di proteine HLA-DQ2.5 che essi producono. Questo risultato, che conferisce un ruolo fondamentale al processo di formazione e regolazione degli RNA messaggeri nel meccanismo di attivazione della risposta infiammatoria contro il glutine, potrebbe spiegare perché le classi cliniche di rischio dei soggetti identificate secondo il metodo del dosaggio dei geni HLA predisponenti non sono sempre congruenti con la configurazione genetica (omozigosi verso eterozigosi): la configurazione genetica potrebbe non essere l’unico fattore determinante il rischio, ma anche la regolazione degli RNA messaggeri potrebbe svolgere un ruolo fondamentale che varia da soggetto a soggetto.

Prospettive e conseguenze future: I risultati dello studio indicano che in aggiunta alla determinazione del genotipo HLA (presenza dei geni di rischio e loro configurazione, omozigosi o eterozigosi) anche la valutazione dell’espressione dei geni HLA di classe II associati alla celiachia dovrebbe essere utilizzato come strumento quantitativo di previsione del rischio di ammalarsi. A completamento dei risultati finora ottenuti dallo studio, le misurazioni molecolari dovranno essere valutate anche rispetto ai dati clinici che definiscono le diverse classi di rischio. In particolare lo studio dovrà essere esteso a pazienti appartenenti a differenti classi di rischio con altri genotipi, per esempio con due copie del gene DQB1*02 ed una del gene DQA1*05 oppure con i due geni di rischio su cromosomi diversi. Sulla base dei risultati ottenuti si potrà lavorare alla progettazione di un dispositivo diagnostico che permetta grazie ad un prelievo di sangue di determinare non solo il genotipo HLA ma anche l’espressione RNA dei geni di rischio nel singolo soggetto, fornendo indicazioni sia per un soggetto a rischio sulla probabilità di ammalarsi, sia per un paziente celiaco sulla gravità della patologia e quindi l’intensità della risposta infiammatoria.

 

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