Titolo pagina

Presso la Cattedra di Immunologia della Facoltà di Scienze Biotecnologiche, indirizzo Agrario-Vegetale, è stato messo a punto un metodo di identificazione della gliadina che prevede l'uso della citofluorimetria a flusso. Il test citofluorimetrico, paragonato al test ELISA, risulta essere estremamente più sensibile; inoltre azzera completamente l'interferenza del tampone di estrazione, che nel caso del test ELISA è il fattore limitante, inficiando la ripetibilità e la sensibilità del test. L'intento di questo studio è stato quello di aumentare la sensibilità delle tecniche attualmente in uso, considerando la carenza di informazioni circa l'effetto che l'assunzione di piccolissime dosi di gliadina nel lungo termine potrebbe causare negli individui affetti dalla intol-leranza al glutine.

Lo scopo finale, tuttavia, è quello di mettere a punto un test "home-made" di larga diffusione, al pari di un qualsiasi kit diagnostico reperibile in commercio, che consenta, a chiunque lo desideri, di accertarsi dell'assenza di glutine negli alimenti certificati come tali.

Il citofluorimetro è uno strumento che consente un' analisi accurata di singole cellule ma anche di antigeni più piccoli, previo adsorbimento su piccole particelle di latice nell' ordine dei mm di diametro.

Le particelle sono allineate attraverso un sistema fluidico in una singola fila e sono analizzate una per una attraverso un fascio luminoso focalizzato.

Una particella o una cellula colpita da un fascio luminoso focalizzato emette segnali relativi alle sue caratteristiche fisiche

(diametro, volume, rapporto nucleo citoplasma e rugosità superficiale) in base a fenomeni di rifrazione, riflessione e diffrazione. Molte molecole possono essere individuate mediante ligandi fluorescenti o con specifici anticorpi marcati con fluorocromi come l' isotiocianato di fluoresceina (FITC) o la ficoeritrina (PE).

I segnali vengono raccolti da un sistema di lenti, specchi e filtri ottici e successivamente amplificati e digitalizzati per essere inviati ad un elaboratore che provvede alla presentazione statistica dei dati.

Attraverso tale metodica è stata studiata la possibilità di individuare le prolammine tossiche per il celiaco in diversi alimenti, con particolare riferimento alla gliadina.

Il test citofluorimetrico che abbiamo utilizzato nel nostro lavoro è strutturato nel seguente modo.

Le particelle sono messe in incubazione a contatto con il nostro antigene (gliadina o una matrice alimentare) per favorirne il legame.

un peptide della gliadina, per questo sono stati immunizzati dei ratti con un peptide di 16 AA presente nella sequenza della γ-glia-dina coniugato con un carrier, la BSA (albumina di siero bovino).

L'antisiero prodotto è stato adsorbito con la BSA per rimuovere gli anticorpi che riconosceveno tale molecola, ed ottenere un reagente specifico per la gliadina.

La gliadina rappresenta circa il 50% del glutine. Per tale motivo, andando a considerare i valori limite imposti dal Codex Alimentarius negli alimenti gluten-free, ci siamo riferiti a 10 e 100 ppm di gliadina.

Allo scopo di valutare la reale quantità di gliadina presente negli alimenti, tenendo conto delle possibili interferenze date dalla matrice alimentare, sono state effettuate delle prove di recupero. Una matrice alimentare sicuramente gluten-free (farina di mais) è stata appositamente contaminata con quantità note di gliadina, al fine di verificare la percentuale di recupero della gliadina. Per ottenere una curva di titolazione da 1 a 100 ppm, quantita scalari di giadina sono state aggiunte ad 1 mg di farina gluten-free in 1 ml di etanolo al 70%.

Inoltre sono state utilizzate, come controllo positivo, particelle sensibilizzate solo con 100 ng di gliadina per ottenere la percen

Si saturano eventuali siti sulle particelle rimasti liberi con polvere di latte.

Si tratta con un anticorpo specifico per il nostro antigene.

Si lava e si lascia incubare con un secondo anticorpo rivolto verso il primo coniugato con un fluorocromo per essere visibile al citofluorimetro.

Il primo passo è stato produrre gli anticorpi contro

tuale di recupero. Il confronto tra i picchi riferiti a 100 ppm e 100 ng ha consentito di calcolare una percentuale di recupero pari al 92,5%.

Una volta raggiunte le condizioni ottimali siamo andati a testare una serie di prodotti appartenenti alle più note case produttrici di alimenti glu7ten-free (Bi-aglut, Nutricia, Schär, Aproten, Plasmon). Inoltre abbiamo anche testato una vasta gamma di prodotti forniti da un laboratorio artigianale del "senza glutine" (Alimenta 2000) e alcuni prodotti definiti "a rischio". Quest'ultima categoria comprende alimenti che, in teoria idonei ai celiaci, potrebbero essere stati contaminati nelle varie fasi di produzione, o prodotti con ingredienti di non chiara provenienza botanica.

L'estrazione della gliadina dagli alimenti è stata effettuata con etanolo al 70% sciogliendo una aliquota dell'ali-mento omogeneizzato nel tampone, centrifugando e recuperando il sovranatante. Gli estratti sono stati testati con il test citofluorimetrico prima descritto.

L'effettiva concentrazione di gliadina ottenuta per ogni alimento, è stata calcolata tramite un'opportuna retta di titolazione. Nella tabella seguente sono riassunti i risultati.

I valori riportati sono riferiti alla gliadina ed è quindi opportuno ricordare che i limiti legislativi sono di 10 e 100 ppm (corrispondenti a 20 e 200 ppm di glutine).

La disponibilità di un metodo che identifica anche 1 ppm di gliadina offre, almeno da un punto di vista tecnico, la possibilità di abbassare ulteriormente il livello di gliadina consentito negli alimenti gluten-free. È utile ricordare in questo contesto che i limiti legislativi sono stati stabiliti tenendo conto della sensibilità dei metodi disponibili, e non in base all'evidenza che quantità di gliadina inferiori fossero tollerate dal paziente.

Avere a disposizione un test di così facile utilizzo, consentirebbe inoltre di controllare la filiera di produzione in corso di lavorazione, cercando di modificare la flow-chart per l'ottenimento di un prodotto che sia effettivamente esente da glutine. Tutto ciò, contribuirebbe in maniera inequivocabile a far abbassare i costi della gamma dei prodotti "gluten-free".